La clonación en serie de ratones no se puede sostener indefinidamente

En febrero de 1997 conocimos a la oveja Dolly, el primer animal clonado a partir de células adultas. El experimento había sido realizado por el equipo de Ian Wilmut, en el Instituto Roslin de Edimburgo. Dolly nació de uno de los casi trescientos embriones de oveja reconstruidos a partir de un óvulo enucleado y de un núcleo de una célula somática, de la glándula mamaria de otra oveja. A pesar de la paupérrima eficiencia del proceso el artículo que reportaba este experimento tuvo un impacto enorme en biología, pues en efecto demostraba que era posible reprogramar el núcleo de una célula diferenciada para que volviera a sustentar y completar el desarrollo embrionario, dando lugar a un nuevo ser vivo, que era un clon (nuclear) del animal que había donado el núcleo de una de sus células para reconstruir el embrión. Dolly fue única en muchos sentidos. Tuvo una existencia normal, como cualquier otra oveja, hasta que tuvo que ser sacrificada en 2003, debido a una infección viral grave que le afectó a los pulmones, seguramente inducida por el celo protector de sus creadores, que la mantuvieron en corral, junto a otras ovejas, más tiempo del necesario y acabó infectándose. Por el contrario, cuando la técnica de clonación (llamada técnicamente de transferencia nuclear de células somáticas) se reprodujo en otros animales (otras ovejas, cabras, vacas, cerdos…) se constató que en un porcentaje considerable pero variable de los intentos los animales clonados presentaban alteraciones que podían llegar a ser incompatibles con la vida, lo cual sugería que el proceso de clonación era, no solo poco eficiente, sino que también propiciaba la aparición de diversas anomalías durante el desarrollo embrionario y en el periodo perinatal. Estos problemas solamente se detectaron en mamíferos clonados, no en otros grupos de animales, como los anfibios, ni en plantas clonadas.  

La clonación del ratón no fue posible hasta julio de 1998, cuando apareció en la revista Nature el estudio realizado por un investigador japonés, experto embriólogo, llamado Teruhiko Wakayama, que por aquel entonces trabajaba en el laboratorio de Ryuzo Yanagimachi (1928-2023) en Hawái, un referente en técnicas de reproducción asistida. Este estudio incorporó la técnica de la piezoinyección (una microinyección más sofisticada, equipada con un casi imperceptible movimiento de vaivén que permite atravesar las membranas celulares limpiamente, sin romperlas) para introducir los núcleos de las células en los embriones enucleados, una estrategia menos agresiva que la microinyección directa tradicional que se había usado con los embriones de oveja, que son mucho más robustos que los frágiles embriones de ratón. Ese primer ratón clonado, una hembra, fue bautizada como “Cumulina” por su origen: el núcleo de las células del cúmulo (que rodean al óvulo en el folículo ovárico) que se usaron para la clonación. Ya en ese primer trabajo Wakayama demostró su refinada técnica de piezoinyección logrando clonar un ratón clonado, es decir, usando núcleos de células del cúmulo de las primeras ratonas clonadas, logró volver a obtener clones (dos generaciones de clonación).  

En el año 2000, Wakayama logró iterar los ciclos de clonación un mayor número de veces y consiguió llegar hasta seis generaciones de ratones clonados, que nacían y se comportaban con aparente normalidad.  

Ahora Wakayama vuelve a la palestra con un nuevo estudio, publicado en Nature Communications, pacientemente desarrollado durante más de veinte años de trabajo, en el que rompe cualquier récord anterior y reporta la clonación seriada de ratones de generaciones sucesivas llegando hasta la 58ª generación. En otras palabras, a partir de uno de los primeros ratones clonados derivados de los núcleos de células del cúmulo, ha ido usando sucesivamente nuevos núcleos de estas células de los ratones que nacían clonados para obtener la siguiente generación de ratones clonados. Y así sucesivamente hasta completar 57 ciclos de clonación, con un total de más de 1200 ratones clonados.  

Este es un experimento heroico, del todo impresionante y seguramente irrepetible. Dudo que haya otros investigadores tan técnicamente avanzados y con la suficiente perseverancia para repetir este estudio. Adicionalmente, dudo que un experimento similar pudiera llevarse a cabo hoy en día en Europa, por las restricciones normativas que impone la legislación de protección de los animales usados con fines científicos. Y, sin embargo, se trata de un experimento único de investigación básica que permite responder a preguntas biológicas tan relevantes como entender por qué los mamíferos optamos por incorporar un sistema de reproducción sexual, y no uno asexual.  

La novedad de este último estudio longitudinal es que Wakayama ha podido analizar las características de los ratones clonados nacidos en cada generación. Hasta la generación 26 los porcentajes de ratones clonados nacidos a partir de los embriones reconstruidos fueron aumentando progresivamente, desde un 7 % inicial hasta un 15,5 %. A partir de la generación 27 observó un declive en estos porcentajes, hasta llegar al 0,6 % de éxito con el que nacieron los ratones de la generación 58. Estos últimos ratones murieron, todos, un día después de nacer, impidiendo que la serie de clonaciones continuara. Sorprendentemente, la esperanza de vida de todos estos ratones se mantuvo relativamente constante y todos sobrevivieron alrededor de dos años, como cualquier otro ratón control no clonado, exceptuando los de la última generación. Tampoco detectaron la acumulación de alteraciones epigenéticas en sus genomas, ni cambios significativos en la expresión de los genes ni en la fertilidad.   

Sin embargo, al analizar en detalle el genoma de estos ratones clonados en serie, sí que constataron la acumulación progresiva de mutaciones, incluidas las más perjudiciales (deletéreas), lo que probablemente explicara la caída en los porcentajes de nacimientos a partir de la generación 27 hasta llegar a la generación 58, en la que ningún ratón sobrevivió. En promedio, el estudio indica que en cada generación clonada se añadían 70 mutaciones puntuales y 1,5 variaciones estructurales (deleciones, inversiones, inserciones, duplicaciones, traslocaciones de fragmentos de cromosomas). Parece que hasta la generación 25 estas anomalías cromosómicas pudieron ser corregidas o eliminadas, pero tras esta generación las mutaciones siguieron acumulándose sin remedio, sin que pudieran ser reparadas, lo cual coincide aproximadamente con el inicio del declive en los porcentajes de nacimientos.  

El objetivo subyacente a todos estos experimentos y lo que ha preocupado a Wakayama desde hace años es entender por qué los mamíferos hemos evolucionado y optado por un sistema de reproducción sexual, a partir de óvulos y espermatozoides producidos por meiosis en ovarios y testículos, y con una variación genética consubstancial a cada generación, y no hemos optado por reproducirnos asexualmente, como pueden hacer algunos anfibios, reptiles y peces, mediante un procedimiento simulado en este estudio a través de las clonaciones seriadas.  

Se acepta que la reproducción sexual permite aumentar la diversidad genética lo cual permite a los individuos que nacen adaptarse diferencialmente a un medio ambiente cambiante. Sin embargo, estos experimentos de Wakayama indican que la clonación seriada también acumula mutaciones. Es decir, también se logra diversidad genética mediante reproducción asexual. También se asume que una reproducción asexual acumularía mutaciones de forma incremental hasta llegar a ser incompatibles con la vida, un hecho que Wakayama demuestra experimentalmente por vez primera al llegar a ratones de la generación 58, que ya no sobreviven. Por el contrario, ratones criados durante más de 60 generaciones de forma natural, mediante reproducción sexual, no muestran este declive en la fertilidad o la supervivencia.

Lo novedoso es haber dado continuidad por 20 años a más de 25 generaciones de reclonación de ratonas juveniles, detectando así algunas anomalías fenotípicas y genéticas en los individuos reclonados después de la generación 26, demostrando así que la reclonación no puede ser eterna. 

Todos los resultados aportan cierta evidencia de algunas anormalidades fenotípicas y genotípicas en ratonas juveniles reclonadas, por ejemplo: 

• Evidencian anormalidad en la capa espongiotrofoblástica y áreas de la zona del laberinto, en placentas. 
• Un efecto nulo de la tricostatina (TSA-inhibidor de las enzimas deacetilasas de histonas -HDAC) para mejorar la reprogramación nuclear de las células somáticas utilizadas para reclonar las ratonas, particularmente a partir de la generación 26. 
• La alteración epigenética en ciertas histonas y su acetilación. 
• El número reducido de células en los embriones reclonados, particularmente en la masa celular interna. 
• Las mutaciones letales en los ovocitos de ratonas reclonadas, tanto nucleares como citoplasmáticas. 
• La acumulación de mutaciones de novo en ratonas reclonadas, particularmente: variaciones en nucleótidos simples, variantes estructurales del genoma, la pérdida de un cromosoma X y de la heterocigosis en algunos cromosomas, la translocación de algunos cromosomas somáticos. 

Esto, debido a la ausencia de recombinación cromosómica en la reproducción por clonación, que previene la selección natural y provoca mutaciones que se acumulan progresivamente entre las generaciones de re-clones. 

El documento explica que más allá de la generación 25 ya no conviene reclonar ratonas juveniles. 

Ignoro si como país de la Unión Europea, España prohíba la clonación o a qué nivel. Pero, dado que en México sí está permitida a nivel de investigación, así como para su aplicación en animales con fines productivos y de rescate de especies, mi recomendación sería permitirla en ese mismo sentido, pero no en humanos, hasta no sortear todos los obstáculos inherentes a la reprogramación de la célula somática donadora de núcleo (para lo cual es imprescindible seguir investigando en otras especies de mamíferos). Por tanto, recomendaría favorecer su aplicación con fines de investigación, productivos y de rescate de especies en mamíferos hasta solucionar el problema, antes de decidir aplicarla en humanos. 

En cuanto a la reclonación, considero que restaría evaluarla en otras especies fuera del ratón, para determinar hasta qué generación soportaría sin afectar el genotipo ni fenotipo del individuo reclonado. El estudio me pareció muy interesante.